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1、激发光源(激光)
2. 样品激励和信号采集部分
3. 波长选择部分
4.探测器
根据波长选择部分,拉曼光谱技术可分为两种类型[图 3]: 1. 基于色散的拉曼光谱系统。 2. 基于傅里叶变换的拉曼光谱系统(FT-Raman)[1]。 对于前者,检测到的拉曼信号通过光栅等分光器件进行分光,然后利用ccd和二极管阵列同时检测不同波长的拉曼信号。 对于后者,检测器采用PMT、APD等点检测器,得到的原始信号是拉曼信号经过迈克尔逊干涉仪后的信号,对干涉信号进行傅里叶变换得到拉曼光谱。 因为 FT-Raman 测量光谱需要很长时间,大约需要 30 分钟。 因此,目前主流的拉曼设备是基于色散的拉曼光谱系统。
图1 拉曼光谱系统分类及基本组成 (a)色散拉曼系统 (b)傅里叶变换拉曼系统
下面介绍类色散拉曼光谱系统各组成部分的技术要求。
#激发光源
由于拉曼信号比较弱,为了获得可检测的拉曼光谱,激发光源需要使用激光。 二十年前,氩和氪离子激光器是主要使用的激发源。 近年来,随着半导体激光器技术的发展,一些近红外工作波长的半导体激光器也成为主流。 根据激发波长的不同,激发光源可分为三种类型[1],它们各有优缺点。
1、紫外光源,波长有244nm、257nm、325nm、364nm
2、可见光源,457nm、488nm、514nm、532nm、633nm、660nm
3、近红外光源,785nm、830nm、980nm、1064nm。
紫外光源通常是氩离子激光器。 在紫外光激发的条件下,分子可以进入电子激发态,从而实现共振拉曼激发,可以显着提高拉曼信号强度。 此外,当被紫外光(<270nm)激发时,拉曼光谱和荧光光谱处于不同的波长范围内,因此紫外拉曼可以消除荧光的影响。 紫外激发可以对蛋白质、DNA、RNA等生物样品产生特异性拉曼增强,从而实现对样品特定结构的分析,这是可见光无法实现的[2]。 此外,由于紫外光在半导体中的穿透深度一般为数纳米,因此紫外拉曼可用于处理样品表面的薄层(常见于新型硅基材料SOI材料)。
但由于紫外光束是不可见的,而紫外激光器相对较大、更复杂、更昂贵,目前的紫外拉曼实验仍属于高端技术,需要高水平的专业技术人员操作。 此外,由于紫外光子的能量较高,样品在紫外激光照射下更容易被烧毁或降解,生物样品也更容易发生变异[3]。
可见光激光器通常是二极管激光器,532nm激光器通常是半导体泵浦固体激光器(DPSS)激光器。 与紫外光激发的拉曼系统相比,可见光拉曼系统的激发光源体积小、价格便宜。 对镜头、探测器等无特殊要求,也不易对样品造成损伤。 此外,尽管拉曼信号弱于紫外光,但由于信号波长较短,可见光的拉曼信号强度仍高于近红外激发的拉曼信号强度[1]。
但在可见光范围内,生物样品和有机样品会产生强烈的荧光光纤光谱仪的优缺点?,因此可见光激光器通常用于检测无机样品。 对于有机和生物样品光纤光谱仪的优缺点?,通常使用近红外激光激发。
近红外激光器通常是二极管激光器,1064nm激光器通常是Nd:YAG激光器。 近红外激光激发样品产生的荧光信号比基于可见光的拉曼系统 [图 4][4] 小得多。 此外,近红外激光比可见光具有更大的穿透深度,因此近红外拉曼系统常用于生物样品和有机样品的研究。
图2 不同激发光波长下荧光背景对比,波长越长,荧光背景越小
但是,由于拉曼信号强度与拉曼散射波长的四次方成反比,当使用近红外激发时,拉曼信号会比使用可见光和紫外光激发时弱很多。 此外,拉曼信号的波长达到1000nm。 在此范围内,普通CCD的信噪比较低,因此需要特殊的CCD,如深耗尽CCD。
#sample激励和信号采集部分
在拉曼系统中,激发光一般通过光纤传输或使用物镜/透镜聚焦在样品上,然后通过光纤或透镜收集产生的拉曼信号,然后传输到光谱仪进行分析。分裂并由检测器检测。 具体不同的样品激发和收集配置可以在第 4 章中找到。
#波长选择部分
类色散拉曼系统主要分为两种,一种是使用单色器+PMT,另一种是使用多色器+CCD[3]。 而单色仪+PMT系统需要扫描光栅来检测不同波长的拉曼信号,因此需要较长的时间才能检测到完整的拉曼光谱。 随着半导体技术的发展,CCD现在也具有更高的灵敏度和信噪比,因此采用多色仪+CCD成为主流的拉曼系统类型[图5]。 由于常见的拉曼光谱峰宽为~20cm-1[5],因此要求多色光谱仪的分辨率至少优于10cm-1。 另外,拉曼光谱一般分布在500-1800cm-1,这个区域一般称为指纹区,所以需要设计光栅,让CCD检测到这个区域的信号。
图3 基于多色仪和CCD的检测系统
#探测器
由于拉曼信号非常微弱,对CCD的灵敏度要求很高,因此通常采用背照式CCD来提高量子效率。 为了检测785nm激光激发的信号,探测器需要在1000nm附近有较好的响应,因此需要使用深耗尽型CCD[图6]。 另外,为了降低暗噪声的影响,通常需要对ccd进行降温。
图 4 不同类型 CCD 的量子效率曲线。 背照式 CCD 显着提高了量子效率。深度耗尽的 CCD 提高了近红外响应
#拉曼信号处理方法
拉曼光谱包括许多拉曼峰,每个拉曼峰的主要信息包括峰的位置、宽度和强度。 为了从拉曼光谱中获取更多信息,需要对拉曼光谱进行进一步处理。 首先是去除拉曼光谱的荧光,校正光谱仪的强度响应,校准波长等,以获得波长和峰值准确的拉曼光谱。 然后可以对拉曼光谱进行以下三种处理【图7】
图5 拉曼光谱的三种处理方法
1、直接观察拉曼光谱峰高和光谱位置的变化,可以分别得到分子浓度和分子结构的变化。 更适用于定性分析,如研究不同疾病的生物组织的成分变化[6]。
2. 首先采集一个包含足够大样本的谱库,然后在获取新的样本信号时进行分类算法,确定未知样本属于谱库中的哪个样本。 从而实现样本鉴定、疾病诊断等。 常见的分类算法有PCA-LDA、PLS-DA等[7]。
3. 由于拉曼信号强度与分子浓度成正比。 因此,混合物的拉曼光谱可以看作是各组分拉曼光谱以其浓度为权重的叠加。 因此,可以采用线性分解、MCR-ALS等算法得到混合物中各组分的浓度。 这种方法常用于微拉曼系统[8]。
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