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3. 如何解读荧光光谱（稳态）

3a：荧光光谱分为：激发光谱（PLE）和发射光谱（PL）。

激发光谱：固定发射光的波长，改变激发光的波长，记录荧光强度随激发波长的变化。

发射光谱：固定激发光的波长，记录不同发射波长下荧光强度随发射波长的变化。

无论是激发还是发射荧光光谱图，都记录了发射荧光强度随波长的变化。 因此光纤光谱仪区别，在荧光光谱中，纵坐标是强度，横坐标是波长。 首先，可以从图中得到峰位和半峰宽。 峰位的视觉反映就是荧光的颜色； 半峰宽表示荧光的纯度。

图 3

PS：图3摘自Nano Letters, 2, 1027

荧光光谱通常与吸收光谱一起出现。 所以它可以与分子的吸收光谱进行比较。 图3A显示了同一物质的吸收光谱（UV-Vis）、荧光激发光谱（PLE）和荧光发射光谱（PL）。 从图中不难发现，激发光谱与吸收光谱非常相似。 但两者有本质的不同。 吸收光谱的纵坐标为吸光度（Absorbance），反映物质对光的吸收； 荧光光谱的纵坐标是分子发出的荧光强度（Intensity），它不仅与物质的吸光能力有关，而且与其有关。 与量子效率有关。 在很多研究体系中，往往将两者结合起来分析问题（我会在后面的内容中举例说明）。

3b：斯托克斯位移和发射光谱形状。

所谓荧光光谱通常是指荧光发射光谱。 大多数物质的荧光发射光谱与图 3A、3B 所示的相似，并且会发生红移。 这种现象称为斯托克斯位移。

为什么会发生斯托克斯位移：如图1所示，处于激发态（如S1）的电子并不是直接辐射跃迁到基态（S0），而是先经历振动弛豫、内部转变等过程。这些过程消耗一些能量。 同时，跃迁到基态的电子也经历了一系列的振动弛豫。 这些原因导致能量损失，在光谱图中反映为光谱中的红移。

图 4

PS：图4摘自Principles of fluorescence Spectroscopy, Joseph R. Lakowicz

研究发现，荧光发射光谱的形状与激发波长无关，但与吸收光谱保持一定的镜像对称性，如图4所示。前者是由于卡沙定律，无论哪种激发态电子被激发到，会先弛豫到S1，然后辐射跃迁到基态发射荧光，所以发射光谱与激发波长无关。 后者是因为电子基态和电子第一激发单重态的振动能级相似光纤光谱仪区别，振动跃迁概率相似，所以是对称的。 请参见下面的图 5。

图 5

PS：图5摘自Principles of fluorescence Spectroscopy, Joseph R. Lakowicz

如果仔细观察，你会发现图4中横坐标的刻度并不均匀，这是因为分子的吸光度和相对光子通量与波长的比值不同（详见“荧光分析”）。

4.量子效率

量子效率和荧光寿命是荧光光谱中非常重要的信息。 量子效率的定义是：荧光物质发射的光子数与吸收的光子数之比。 注意量子效率和荧光强度之间的差异。 某种物质的量子产率高，并不代表它的荧光强度就一定高。 荧光强度不仅与量子效率有关，还与物质的吸光度有关。 测量量子效率的方法有两种：绝对法和相对法。

绝对法：

绝对量子效率不需要标准作为参考，其测量误差也比较小。 如图6所示，首先选择合适波长、稳定的单色LED作为光源（一般发射波长为400-450nm）作为激发光源。 待测样品用溶剂逐步稀释成一系列不同浓度的溶液。 在稀释溶液达到稳定平衡后开始测量绝对荧光效率。 打开激发光源，将小瓶中的空白溶液和一系列准备好的待测溶液放入光学积分球中，此时吸收的激发光子和发射的荧光光子通过一系列的光学积分球. 反射和吸收最终通过光纤传输到QE65000光谱仪系统，记录吸收后的激发光子数和发射荧光光子数，根据定义即可计算出绝对量子效率。

图 6

PS：图6和绝对法的描述摘自浙江大学博士论文《核壳量子点激子态的合成与控制》。

相关方法：

分析物的量子效率是通过将分析物的积分荧光强度与相同激发条件下的已知量子效率进行比较来计算的。 计算如下：

PS：公式来自《荧光分析》

其中：Y1、Y2分别代表对照品和待测物的量子产率； F1、F2分别为对照品和待测物的积分荧光强度； A1、A2分别为对照品和待测物的吸光度。

参考：

《荧光分析法》，许金欧； “荧光光谱学原理”，Joseph R. Lakowicz； 《荧光光谱学导论》，《核壳量子点激子态的合成控制》，牛元； 维基百科相关词条； 百度词条； 纳米快报，2，1027。